核酸提取被用于許多分子生物化學(xué)試驗(yàn)和診斷，是克隆、轉(zhuǎn)化、酶切、體外轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、測序等試驗(yàn)的***個步驟。然而由于細(xì)胞內(nèi)存在大量蛋白質(zhì)、碳水化合物、原始樣品中的代謝物以及其它污染物，提取高質(zhì)量的核酸并非易事?，F(xiàn)階段的層析柱核酸提取方法有：

1、一種新的層析柱技術(shù)-雙層柱技術(shù)

事件：

       發(fā)明了一種新的層析柱技術(shù)-雙層柱技術(shù)，以及基于該新雙層柱的核酸提取方法，用來克服常用的基于硅膠提取和基于陰離子交換提取核酸兩者的缺點(diǎn)，使核酸提取方法更加簡單、快速、***、可靠，特別是在血漿和尿液的液體活檢中具有非常重要的應(yīng)用價值13-14。

結(jié)構(gòu)：

       雙層柱由2種膜組成：***層為陰離子交換膜二乙胺（DEAE），第二層為二氧化硅膜。

原理：

（1）樣品中的核酸結(jié)合到***層陰離子交換膜上，起核酸濃縮器的作用，

（2）已結(jié)合的核酸從***層膜洗脫, 然后結(jié)合到第二層二氧化硅膜, 這是因?yàn)椴捎昧穗p功能洗脫/結(jié)合液, 也稱為耦聯(lián)液，

（3）***終使用低鹽緩沖液將游離核酸從第二層膜洗脫，獲得目的產(chǎn)物。

優(yōu)點(diǎn): 

（1）特別適用于分離和純化含有極度稀釋的大容量的核酸樣品，例如10mL血漿或50mL尿液；

（2）游離的小片段DNA（80～250bp）回收率高,可比常規(guī)硅膠提取法高出4倍, 適用于血漿及尿液游離核酸的提??；

（3）不需要蛋白酶處理；

（4）提供更高純度和更少抑制劑的核酸樣品；

（5）洗脫的核酸可直接用于下游應(yīng)用, 包括焦磷酸化激活的聚合反應(yīng)（Pyrophosphorolysis Activated Polymerization，PAP）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、及二代測序等；

（6）此外，本方法快速、簡便，無需接觸苯酚及氯仿等毒性強(qiáng)烈的有機(jī)溶劑，無需復(fù)雜繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作，操作全程可在短時間內(nèi)完成。

事件：發(fā)表了一項(xiàng)以硅膠或二氧化硅為基礎(chǔ)的提取方法1。

材料：微孔玻璃，嵌入二氧化硅顆粒的濾膜，硅膠顆粒，二氧化硅構(gòu)成的藻土型樹脂，和玻璃纖維

步驟：

（1）在高濃度離液鹽的存在下，DNA或RNA會粘結(jié)到硅膠樹脂或膜的表面，其它污染被沖洗走，

（2）然后用水或低鹽緩沖液洗脫DNA或RNA，現(xiàn)在已成為一種流行的核酸提取方法1-6。

原理

（1）在高濃度的離液鹽，例如碘化鈉（NaI），高氯酸鈉（NaCIO4），鹽酸胍（GuHCl）, 和異硫氰酸胍（GuTC）等的條件下，帶負(fù)電荷的DNA 骨架與帶正電的硅膠表面具有高度的親和力。

（2）現(xiàn)階段已對離子強(qiáng)度、溫度、pH值、DNA大小和構(gòu)象與核酸結(jié)合到硅膠表面上的影響進(jìn)行了研究，例如，硅膠表面的結(jié)合能力與離液鹽濃度是呈線性相關(guān)的。在一個給定的離液鹽濃度下，pH值越低則所有類型的DNA與硅膠表面的結(jié)合能力越高7。

（3）常用的將核酸與硅膠表面粘結(jié)的試劑：異硫氰酸胍（GuTC）、鹽酸胍（GuHCl）、碘化鈉（NaI）、高氯酸鈉（NaCIO4）。條件控制為：在乙醇或異丙醇的條件下, 以及控制結(jié)合試劑PH值為6至7.5條件下，其結(jié)合效率顯著改善。

應(yīng)用：

這種層析柱常用硅膠樹脂或膜作為固定相，并常用離心或真空來驅(qū)動,例如：

Promega公司的PureYield質(zhì)粒小量提取系統(tǒng)

WizardPlus小量DNA制備純化系統(tǒng)

Qiagen 公司的QIAprep小量制備試劑盒

Bioland公司的EZgene質(zhì)粒小量制備純化試劑盒

優(yōu)點(diǎn)：快速、簡便、有效、所純化的DNA質(zhì)量高并可以用于多種下游應(yīng)用

缺點(diǎn)：高達(dá)3倍體積的離液鹽溶液被添加到1份體積的DNA或RNA樣品中方可達(dá)到硅膠結(jié)合DNA所需的有效離液鹽的濃度，因而血漿和尿液液體活檢標(biāo)本的起始體積受到很大***。

3、陰離子交換為基礎(chǔ)的提取方法

步驟：

在低pH值及低鹽濃度下，DNA可與陰離子交換劑結(jié)合，隨即可用高pH值及高濃度的鹽溶液來洗脫DNA8-11。

原理：

是基于DNA主鏈上的帶負(fù)電荷的磷酸根離子與分子表面上帶正電的DEAE等基團(tuán)之間的相互作用，溶液中的鹽濃度和pH值決定了是否結(jié)合或脫DNA。

應(yīng)用：

（1）通常以微珠為基礎(chǔ)的陰離子交換柱多是重力流動型的，例如QIAGEN公司的基因組柱試劑盒，QIAGEN公司的樹脂由有一層二乙基氨基乙醇（DEAE）官能團(tuán)的涂層；PALL公司的AcroSep層析柱，它是由弱的陰離子交換樹脂DEAE陶瓷HYPERD F微珠以及Q強(qiáng)陰離子交換陶瓷HYPERD F微珠組成的。

（2）與基于微珠柱子相比，通常使用的為離心型或真空抽吸驅(qū)動型陰離子交換膜式柱子，例如Vivapure弱陰離子交換微型D膜離心柱、Vivapure強(qiáng)陰離子交換Q膜離心柱，它們具有流速高、成本低、高通量的優(yōu)勢12。

優(yōu)點(diǎn)：簡單、安全、可靠，其所制備的核酸具有相當(dāng)于兩次CsCl梯度離心純化的超純度。

缺點(diǎn)：因?yàn)樵谙疵撘褐泻懈邼舛鹊柠}，洗脫的核酸是不能直接使用的，通常需要一個額外的步驟，例如，乙醇或異丙醇沉淀以去除鹽。

綜上所述，雙層柱提取技術(shù)無論是在對樣本的處理、實(shí)驗(yàn)的操作及獲得產(chǎn)物的質(zhì)量上，都是優(yōu)于其他兩種方法的！

事件：發(fā)表了一項(xiàng)以納米磁珠為載體的提取方法1。

材料：納米磁珠及表面包被功能基團(tuán)

步驟：

裂解、結(jié)合、洗滌、洗脫

原理

磁珠表面包被的功能基團(tuán)，可以在結(jié)合液作用下吸附核酸

磁珠的納米金屬核心，可以在磁場的作用下攜帶吸附的核酸定向移動和固定

通過磁場固定磁珠及所吸附的核酸后，可以通過棄去廢液達(dá)到固液分離，除去雜質(zhì)的作用

在洗脫液作用下，磁珠和核酸可以分離

再次固定磁珠，可以得到純凈的核酸

應(yīng)用：

吉恩特的磁珠法核酸提取試劑盒

優(yōu)點(diǎn)：快速、簡便、有效、所純化的DNA質(zhì)量高并可以用于多種下游應(yīng)用，可以高通量自動化地進(jìn)行核酸提取

缺點(diǎn)：受耗材容積***，受核酸自動提取儀效果影響