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目前蛋白質(zhì)表達(dá)譜的研究有兩個技術(shù)難題，一是如何保證蛋白質(zhì)來源的均一。因為體內(nèi)組織器官各種細(xì)胞混雜在一起，如各類神經(jīng)元細(xì)胞，突觸很長，難于分離純化。二是如何在體內(nèi)動態(tài)觀察某類或某些細(xì)胞的蛋白質(zhì)的代謝。
今天荷葉給大家介紹一種體內(nèi)細(xì)胞特異的蛋白質(zhì)代謝譜標(biāo)記方法，該方法對蛋白質(zhì)表達(dá)譜的研究十分有用，希望對科研狗們有點用。
細(xì)胞蛋白質(zhì)標(biāo)記的基本原理：蛋白質(zhì)的合成依賴于轉(zhuǎn)運tRNA合成酶，不同的氨基酸有特定的轉(zhuǎn)運tRNA合成酶。通過對特定轉(zhuǎn)運tRNA合成酶進(jìn)行突變使其改變轉(zhuǎn)運氨基酸的種類，轉(zhuǎn)運非經(jīng)典的氨基酸。
外源補充非經(jīng)典的氨基酸后，待細(xì)胞利用非經(jīng)典氨基酸合成新蛋白后，通過“點擊化學(xué)”（Click Chemistry）的方法將含有非經(jīng)典的氨基酸的蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，可以分離純化新合成的蛋白質(zhì)。
然后進(jìn)行質(zhì)譜分析（BONCAT，bio-orthogonal non-canonical amino-acid tagging，生物正交非經(jīng)典氨基酸標(biāo)記），也可以對非經(jīng)典氨基酸進(jìn)行熒光標(biāo)記，在體觀察蛋白質(zhì)的合成（FUNCAT，fluorescent non-canonical amino-acid tagging）。
甲硫氨酸轉(zhuǎn)運tRNA合成酶的突變，轉(zhuǎn)運疊氮正亮氨酸ANL
疊氮與炔基的點擊化學(xué)反應(yīng)
如何實現(xiàn)細(xì)胞特異的蛋白質(zhì)標(biāo)記呢？可以利用Cre-loxp系統(tǒng)，利用細(xì)胞特異的啟動子驅(qū)動突變的轉(zhuǎn)運tRNA合成酶，在特異的細(xì)胞、特定的時間表達(dá)突變的轉(zhuǎn)運tRNA合成酶。
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