隨著第三代基因編輯技術(shù)——CRISPR/Cas9技術(shù)斬獲2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，“基因編輯”一詞便頻繁地出現(xiàn)在大眾視野中。然而，這把基因的“手術(shù)刀”只有被送到靶細(xì)胞才能發(fā)揮其特定作用，因此，在體內(nèi)精準(zhǔn)遞送基因編輯系統(tǒng)仍然是該技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)之一。

基因編輯工具只有被遞送到靶點(diǎn)部位才能真正發(fā)揮作用，其在應(yīng)用于疾病治療時(shí)主要有兩種遞送形式：一是從患者體內(nèi)提取需要改造的細(xì)胞，在體外用基因編輯技術(shù)進(jìn)行工程化改造后，再回輸至患者體內(nèi);二是通過各種形式的制劑實(shí)現(xiàn)基因編輯系統(tǒng)在體內(nèi)的遞送，把基因“手術(shù)刀”遞送至靶組織或靶細(xì)胞中進(jìn)行治療。

然而，在遞送過程中存在諸多挑戰(zhàn)。首先，為了防止不良反應(yīng)的產(chǎn)生，需要把基因編輯工具準(zhǔn)確遞送體到內(nèi)的特定部位。筆者團(tuán)隊(duì)曾在2021年開發(fā)了一種具有炎癥靶向性的基因編輯前藥系統(tǒng)[3]，選用一種受小分子調(diào)控的Cas9變體，并將這種小分子設(shè)計(jì)成只有在炎癥環(huán)境中才能被激活的前藥，從而減少了基因編輯治療過程中的組織脫靶問題。其次，基因編輯工具通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞并非易事。對于CRISPR/Cas系統(tǒng)而言，遞送主要分為gRNA的遞送和Cas蛋白的遞送。其中，gRNA可以直接以RNA形式遞送，或通過質(zhì)粒DNA形式遞送到體內(nèi)后再完成轉(zhuǎn)錄;而Cas蛋白有3種遞送形式：遞送對應(yīng)的質(zhì)粒DNA、mRNA或直接遞送蛋白。這些生物大分子由于尺寸問題和特殊的荷電性質(zhì)，往往需要特定的載體或物理方法來介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞[4]，如使用病毒載體和非病毒載體、采用顯微注射、電穿孔、基于微流控的技術(shù)等物理方法等[5]。

3代基因編輯工具  (a)ZFN基因編輯技術(shù)；(b)TALEN基因編輯技術(shù)；(c)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)系統(tǒng)。

病毒基因編輯遞送系統(tǒng)

病毒系統(tǒng)是相對來說比較成熟的基因編輯遞送系統(tǒng)，常用的載體有整合酶缺陷型慢病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和腺病毒載體。

整合酶缺陷型慢病毒載體

整合酶缺陷型慢病毒載體由慢病毒改造而來，由于整合酶缺陷而無法將目的基因整合入宿主的基因組中，具有一定的安全性。這類系統(tǒng)可被用于遞送ZFN基因編輯工具。在體外，整合酶缺陷型慢病毒可通過遞送ZFN基因編輯工具的mRNA和供體DNA模板，在各種細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因編輯。然而在某些細(xì)胞系內(nèi)，該系統(tǒng)的編輯效率并不高，同時(shí)，其基因編輯效果會隨著靶點(diǎn)細(xì)胞的***而逐漸減弱[2]。

腺相關(guān)病毒載體

腺相關(guān)病毒載體是一種含有單鏈線狀DNA的小型無包膜病毒，其基因組中包含兩個(gè)反向末端重復(fù)序列，通常需要在輔助病毒的幫助下才能發(fā)揮作用。而重組腺相關(guān)病毒從野生型腺相關(guān)病毒改造而來，傳遞基因時(shí)不需要輔助病毒，已被廣泛用于基因編輯系統(tǒng)的體內(nèi)和體外遞送。有研究表明，在某些情況下，用腺相關(guān)病毒載體遞送基因編輯工具的效率高于整合酶缺陷型慢病毒載體[2]，且遞送CRISPR基因編輯工具時(shí)可以實(shí)現(xiàn)持久的編輯[6]。然而，這類編輯系統(tǒng)的應(yīng)用也存在一系列的挑戰(zhàn)，如重組腺相關(guān)病毒載體所能荷載的基因組大小有限，僅5.0 kb左右，使用時(shí)需要控制“貨物”的大小;同時(shí)，它的持久編輯功能可能導(dǎo)致CRISPR/Cas工具過表達(dá)，造成脫靶效應(yīng);此外，還可能會帶來免疫原性問題，引發(fā)一些免疫毒性[6]。

腺病毒載體

腺病毒載體是一種含雙鏈DNA的病毒，由于感染能力較強(qiáng)、基因不整合到宿主細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，是目前臨床上***常用的基因治療病毒載體。***項(xiàng)用于人體的基因編輯臨床試驗(yàn)就是利用的腺病毒載體遞送系統(tǒng)。CCR5是存在于T細(xì)胞表面的一種可以協(xié)助HIV病毒入侵的受體，在體外用攜帶ZFN基因編輯工具的載體系統(tǒng)敲除CCR5基因后，產(chǎn)生不會被HIV感染的T細(xì)胞。自體移植后，抗HIV小分子藥物治療中斷后，CCR5敲除的T細(xì)胞比正常T細(xì)胞存活得更好[7]。

3種病毒載體[7]

非病毒基因編輯遞送系統(tǒng)

非病毒介導(dǎo)的基因編輯遞送系統(tǒng)盡管基因組編輯酶的效率不如病毒遞送方法，但其核酸酶活性具有瞬時(shí)優(yōu)勢。更重要的是，與病毒載體不同，非病毒載體可以重復(fù)給藥，從而提高基因編輯成功的機(jī)會。

物理遞送方法

通過物理方法破壞細(xì)胞膜或使之變形，將基因編輯工具遞送到細(xì)胞內(nèi)，常用的物理遞送方法有顯微注射、電穿孔、微流控等。

顯微注射是轉(zhuǎn)染效率極高的一種遞送方法，且遞送的“貨物”大小不受***，常用于遞送核酸類大分子，如用微米級別的針頭穿破細(xì)胞膜，將可以編碼CRISPR/Cas工具的質(zhì)粒DNA直接注射到細(xì)胞中。該方法還可以用于遞送mRNA等，從而在胞內(nèi)表達(dá)基因編輯工具[5]。

同顯微注射一樣，電穿孔也是較為成熟的物理遞送方法，通過電場作用增加細(xì)胞膜的通透性，從而介導(dǎo)DNA、核糖核蛋白復(fù)合物等生物大分子進(jìn)入。研究顯示，與DNA相比，電穿孔方法導(dǎo)入核糖核蛋白復(fù)合物時(shí)具有更高的效率，且不易形成脫靶。但由于在體內(nèi)難以控制電穿孔需要的各種參數(shù)，該技術(shù)目前多被用于體外基因編輯。

生物磁珠對細(xì)胞篩選的方法已日漸成熟，原理是將包被一抗的磁珠與細(xì)胞表面對應(yīng)的分子特異性結(jié)合，或者將包被二抗的磁珠與已經(jīng)與細(xì)胞表面分子特異性結(jié)合的一抗結(jié)合。磁珠攜帶與之結(jié)合的細(xì)胞吸附與分離柱或試管上，實(shí)現(xiàn)陽性細(xì)胞或陰性細(xì)胞的分離。洛陽吉恩特生物自主研發(fā)生產(chǎn)了各類生物磁珠，可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。