近日，復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、遺傳工程國家***實(shí)驗(yàn)室黃強(qiáng)課題組與盧大儒課題組合作的關(guān)于基因編輯系統(tǒng)CRISPR-Cas9的研究成果在線發(fā)表于國際知名學(xué)術(shù)期刊《自然·通訊》(Nature Communications)。該成果用冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)方法解析了CRISPR-Cas9的DNA剪切活性結(jié)構(gòu)，在CRISPR-Cas9的DNA剪切機(jī)理研究方面取得了重要進(jìn)展。

       目前，基于細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)發(fā)展出的CRISPR-Cas9技術(shù)已成為核酸提取磁珠***性的基因編輯工具，這一“基因魔剪”可以方便地對(duì)基因組DNA進(jìn)行***、特異性的切割編輯，在生物醫(yī)學(xué)與領(lǐng)域有核酸提取磁珠著巨大的應(yīng)用潛力。為了解該系統(tǒng)的DNA剪切機(jī)理、指導(dǎo)系統(tǒng)的優(yōu)化，過去幾年，眾研究機(jī)構(gòu)陸續(xù)解析了多個(gè)“Cas9-sgRNA-DNA靶鏈”的三元復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。然而，這些復(fù)合物結(jié)構(gòu)并沒有完全揭示出真正的DNA剪切活性構(gòu)象，人們對(duì)CRISPR-Cas9如何通過HNH與RuvC核酸提取磁珠切割DNA單鏈的分子機(jī)制還很不明確。因此，獲得CRISPR-Cas9的剪切活性結(jié)構(gòu)成為了揭示該系統(tǒng)DNA剪切機(jī)理的關(guān)鍵。

       針對(duì)上述研究問題，黃強(qiáng)與盧大儒研究團(tuán)隊(duì)早在2014年就考慮采用冷凍電鏡方法來解決。他們首先構(gòu)建了釀膿鏈球菌Cas9酶 (SpCas9)、sgRNA和DNA的三元復(fù)合物，然后用冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)方法解析該復(fù)合物的溶液結(jié)構(gòu)，獲得了一個(gè)5.2埃分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。

       復(fù)合物結(jié)構(gòu)的原子模型顯示，在已解析的所有結(jié)構(gòu)中，該復(fù)合物的HNH酶活性中心***接近DNA鏈的切割位點(diǎn)；分子動(dòng)力學(xué)模擬及點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)表明，該復(fù)合物的HNH和RuvC核酸提取磁珠活性中心的催化氨基酸可以與DNA解旋單鏈形成切割反應(yīng)所需構(gòu)象。因此，研究獲得的復(fù)合物結(jié)構(gòu)是CRISPR-Cas9的DNA剪切激活構(gòu)象，為***揭示剪切機(jī)理提供了關(guān)鍵的活性結(jié)構(gòu)信息，并為應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)優(yōu)化該系統(tǒng)、降低其脫靶效應(yīng)提供了重要的結(jié)構(gòu)生物化學(xué)基礎(chǔ)。目前，研究團(tuán)隊(duì)正在所得結(jié)構(gòu)的指導(dǎo)下，應(yīng)用蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方法對(duì)CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，以開發(fā)脫靶效應(yīng)低、編輯效率高的新型基因編輯系統(tǒng)。

       據(jù)悉，博士研究生懷聰和碩士研究生李干為論文的并列***作者，黃強(qiáng)教授與盧大儒教授為并列通訊作者。研究團(tuán)隊(duì)利用國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心 (上海) 的電鏡平臺(tái)采集了冷凍電鏡圖像，并主要使用課題組自己建立的電鏡圖像分析與分子建模平臺(tái)完成了三維重構(gòu)和原子模型構(gòu)建工作。有關(guān)研究項(xiàng)目獲得了國家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目支持。