血液基因組DNA提取可以對(duì)各類哺乳動(dòng)物或禽類進(jìn)行DNA提取，使用核酸提取磁珠對(duì)血液進(jìn)行基因組DNA提取，隨著磁珠法核酸提取技術(shù)的不斷普及，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室會(huì)進(jìn)行磁珠法DNA提取，在使用的初期階段，也會(huì)遇到各種各樣的問(wèn)題，近期就有許多老師和我們討論如何利用磁珠進(jìn)行血液DNA提取，我們對(duì)其中的常見(jiàn)問(wèn)題進(jìn)行了總結(jié)，供大家參考。

1、全血上樣量與裂解體系

       全血樣本的上樣量是DNA提取的問(wèn)題，不同的上樣量對(duì)應(yīng)不同的試劑體系，上樣量過(guò)多或多少都會(huì)影響裂解的效果。以GNT-B02的磁珠法血液DNA提取試劑盒為例，標(biāo)準(zhǔn)上樣量為200ul，上下浮動(dòng)不超過(guò)100ul，搭配的裂解液用量為300-400ul，有些老師由于實(shí)驗(yàn)要求，需要大體積的上樣量，這在實(shí)際操作中，就需要對(duì)磁珠法血液DNA提取的操作流程進(jìn)行改良，一般的改良思路是按比例放大裂解體系；但有些實(shí)驗(yàn)的上樣量達(dá)到毫升以上，這種情況下，就不能再簡(jiǎn)單的放大裂解體系了，需要先用紅細(xì)胞裂解液對(duì)樣品進(jìn)行處理，將上樣體積濃縮后，再進(jìn)行血液DNA提取的操作流程優(yōu)化。

2、磁珠結(jié)團(tuán)

      磁珠的現(xiàn)象是實(shí)驗(yàn)中可以觀察到的，由于磁珠本身特性和磁珠所處試劑環(huán)境兩方面造成的，有些磁珠不僅在血液DNA提取過(guò)程中會(huì)結(jié)團(tuán)，在其他的樣本提取中也同樣會(huì)結(jié)團(tuán)，有些老師在初次遇到這種現(xiàn)象的時(shí)候會(huì)感覺(jué)不適應(yīng)，其實(shí)結(jié)團(tuán)現(xiàn)象可以用來(lái)提前預(yù)判實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)團(tuán)往往是吸附了大量核酸，如果哪次實(shí)驗(yàn)沒(méi)有結(jié)團(tuán)，本次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果或許會(huì)不太好，不過(guò)也不能一概而論，雜質(zhì)太多也是引起磁珠結(jié)團(tuán)的原因。

       通過(guò)修改試劑配方，優(yōu)化試劑配置，可以改善磁珠法血液DNA提取過(guò)程中的結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，但是該工作較為復(fù)雜，需要對(duì)各種參數(shù)進(jìn)行調(diào)整。但是對(duì)于磁吸速度較慢的磁珠，結(jié)團(tuán)后能明顯提高磁吸速度，提高實(shí)驗(yàn)效率，只要磁珠在洗脫步驟能夠分散，而且結(jié)果也在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，磁珠結(jié)團(tuán)并不會(huì)影響整體效果。

3、得率低

       得率是影響下游實(shí)驗(yàn)的***直接因素，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，200ul的全血，得率一般在3ug以上，用GNT-B02的磁珠法血液DNA提取試劑盒，能穩(wěn)定在5ug以上，有些老師的實(shí)驗(yàn)結(jié)果只有2ug左右，甚***更低，這就需要***排查兩個(gè)環(huán)節(jié)，一是裂解環(huán)節(jié)，二是洗脫環(huán)節(jié)，若是裂解環(huán)節(jié)的問(wèn)題，往往會(huì)是在結(jié)合的時(shí)候磁珠不結(jié)團(tuán)，或在洗滌的時(shí)候上清液顏色為深***或紅色，這種情況下，更換全新的裂解液，并且嚴(yán)格按照SOP操作是較為效率的解決辦法。

       洗脫環(huán)節(jié)的問(wèn)題，經(jīng)常表現(xiàn)為結(jié)團(tuán)的磁珠未被打散，可考慮加大震蕩力度，或用吸頭吹吸、攪拌。有些老師在得率較低的時(shí)候，喜歡加大上樣量，這可能會(huì)適得其反：過(guò)大的上樣量會(huì)抑制裂解液的裂解能力。

4、純度低

       純度是判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素之一，一般表現(xiàn)為A260/A280和A260/A230，簡(jiǎn)單來(lái)講，A260是核酸的吸光值，A280是蛋白的吸光值，A230是雜質(zhì)（主要是鹽類）的吸光值，對(duì)于血液DNA的磁珠法提取結(jié)果，A260/A280要在1.7-2.0之間，低于1.7存在蛋白污染，高于2.0存在RNA污染；無(wú)論高或低，主要是裂解的影響，需對(duì)裂解環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化；A260/A230一般要求大于1.5，能大于1.8或2.0，若A260/A230小于1.5，則認(rèn)為存在污染，首先考慮鹽類的污染，需對(duì)洗滌環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化，其次考慮醇類的污染，需對(duì)晾干時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，有些提取結(jié)果的A260/A230異常的高，能達(dá)到十幾甚***幾十，這樣的現(xiàn)象并不能很準(zhǔn)確的分析是由什么原因造成的，需要通過(guò)下游實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。誠(chéng)然，對(duì)于常規(guī)的PCR來(lái)講，對(duì)純度的要求并不高，甚純度不達(dá)標(biāo)時(shí)，通過(guò)優(yōu)化PCR體系，也可以實(shí)現(xiàn)PCR的順利進(jìn)行，但對(duì)于一些要求的較高的下游實(shí)驗(yàn)，純度就是很重要的參考，需要在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)才能順利進(jìn)行。

     大家有什么其他疑問(wèn)，歡迎隨時(shí)咨詢洛陽(yáng)吉恩特生物，共同交流、進(jìn)步。